Khoa Chăn
nuôi-Thú y
BỘ MÔN KÍ
SINH-TRUYỀN NHIỄM
|
QUI TRÌNH THIẾT LẬP PHẢN ỨNG TRẮC ĐỊNH XÊ LỆCH NGƯNG KẾT
GIÁN TIẾP CHUẨN (SSIA)
(Các bộ chẩn đoán một số bệnh cảm nhiễm virus)
CHUẨN
BỊ
1. Pha dung dịch sinh lí NaCl 0,85%, hấp tiệt trùng để
nguội.
2. Lấy 10 mg mẫu (phân, dịch họng…) hòa đều vào 100 μL nước
sinh lí (nếu cần, tăng lượng mẫu và dung dịch sinh lí cho đạt tỉ lệ pha 1:10),
quay li tâm 14000 vòng/phút trong 5 phút, hút nước trong suốt phía trên để làm
mẫu kiểm.
3. Lấy huyền dịch kháng nguyên IHA bảo tồn khỏi tủ lạnh (4 oC,
hoặc -20 oC nếu có chất chống hóa băng), không lắc, đưa pipet tự
động vô trùng tận lớp đọng màu đỏ phía dưới, hút 50 μL phần này và pha đều vào
5 mL dung dịch sinh lí để có đủ huyền dịch kháng nguyên IHA 1% thực hiện 1 khay
phản ứng SSIA với 11 mẫu kiểm.
4. Lấy ống kháng huyết thanh 4log2 (tức 16 IHA) ra khỏi tủ
lạnh và để tan chảy rồi trộn lại cho đều tránh hiện tượng phần kháng thể tan
chảy trước so với các tinh thể nước đá. Để thực hiện 1 khay SSIA cần giải đông
600 μL kháng huyết thanh.
THIẾT
LẬP SSIA
1. Xoay khay 96 lỗ và đánh số mới. Một khay có 12 dãy: 11
dãy cho phản ứng kiểm (dãy kiểm), kèm theo 1 dãy cho phản ứng chuẩn (dãy
chuẩn).
2. Dùng pipet tự động cho vào tất cả các lỗ từ lỗ số 2 đến
số 8 của dãy kiểm (thường là từ dãy 1 đến dãy 11) mỗi lỗ 50 μL dung dịch sinh
lí.
3. Cho vào lỗ thứ nhất của mỗi dãy kiểm 50 μL dịch chiết
bệnh phẩm.
4. Cho vào lỗ thứ nhất của dãy chuẩn (thường là từ dãy 12)
50 μL dung dịch sinh lí.
5. Cho vào lỗ thứ nhất của tất cả các dãy kiểm và chuẩn (dãy
1 đến 12) mỗi lỗ 50 μL dung dịch kháng huyết thanh chuẩn có hiệu giá 4log2.
6. Dùng pipet tự động trộn và hút từ lỗ thứ nhất của mỗi dãy
50 μL chuyển sang lỗ kế tiếp và tiếp tục trộn-chuyển cho đến hết dãy thì hút bỏ
50 μL. Thay pipet sau khi hoàn thành
trộn-chuyển mỗi dãy.
7. Dùng pipet tự động cho vào tất cả các lỗ khay 50 μL huyền
dịch kháng nguyên IHA (lưu ý thường xuyên lắc trộn đều kháng nguyên IHA). Không
cần trộn các lỗ khay, dòng xoáy từ pipet tự động đã giúp việc này.
8. Đậy khay đã thiết lập phản ứng bằng một khay khác cùng
loại. Kiểm tra kết quả phản ứng sau khoảng 30 - 60 phút. Có thể duy trì biểu
hiện kết quả phản ứng sau thời gian khá dài (ở 4 oC có thể giữ kết
quả sau vài ngày).
9. Đọc kết quả dựa vào dãy chuẩn (hiệu giá thiết kế là 4log2,
nhưng cũng có thể thay đổi thành 3log2 hoặc 5log2). Nếu có kháng nguyên thì phản
ứng ở dãy kiểm tương ứng lệch trái so với dãy chuẩn. Phản ứng âm tính có ngưng
kết gián tiếp tương tự dãy chuẩn. Nếu có kháng thể (nếu mẫu kiểm là nội quan…)
có thể có kết quả lệch phải do có kháng thể.
Hình: Phương pháp đọc SSIA.
Đường chuẩn kẻ được nhờ phản ứng chuẩn tạo nên ranh giới giữa các lỗ ngưng kết (bên trái) và các lỗ không ngưng kết (bên phải). Ở mỗi dãy kiểm (đánh số) nếu không kết quả khác dãy chuẩn thì âm tính, nếu có lỗ bên trái đường chuẩn tương tự lỗ bên phải đường chuẩn ở dẫy chuẩn thì dương tính. Phải ứng xê lệch sang trái có thể biểu hiện 1, 2, 3 hoặc 4 lỗ ứng với kết quả dương tính 1, 2, 3 hoặc 4 log2 (hiệu giá 2, 4, 8 và 16, hay mỗi thể tích phản ứng 50 μL của dịch virus gốc chứa 2, 4, 8 hoặc 16 đơn vị phản ứng).
Trưởng
nhóm nghiên cứu
PGS.
TS. Phạm Hồng Sơn
Khoa
Chăn nuôi-Thú y
Trường
Đại học Nông Lâm, ĐH Huế
102,
Phùng Hưng, TP Huế
